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荧光定量PCR(qPCR)技术概述

来源:admin  浏览量:  更新时间:2018-07-24 14:23:07

一、qPCR概述——“做的就是专业”:
  基本原理不必赘述!!!方法学上可分为两类:染料法(下左图)和探针法(下右图)。几乎每个实验室/平台都配备了qPCR仪,几乎每位研究生也都会说“我会做qPCR”,但你真的会做吗,计算的结果可靠吗,又是否可以灵活应用呢?

    以下几个问题如果你遇到过且解决不了,那你需要我们:1)每次实验前对于几个样品几对引物几组重复,在计算Mix和加样的时候都要疯了? 2)RNA及cDNA的模版质量是否关注过并能区分好坏?以及OD值对于痕量样本的参考意义?3)是否遇到过不同内参的检测差异就很大,又该用哪个内参进行回归计算呢? 4)熟悉染料法的你,是否了解什么情况下应该用探针法,以及引物和探针设计的技巧呢? 5)溶解曲线双峰、杂峰的解读? 6)复孔之间结果的差异辨别,以及孔板边缘效应? 7)了解反应体系内是否应该含有内标,以及内标对于结果的影响吗? 8)最后,会做标准曲线并能计算核酸绝对含量的人应该就少之又少了吧?



二、服务优势:

1. Bio-Rad CFX96定量PCR系统,定期检测、维护各孔的扩增表现。做到8点各18个复孔标曲R2>0.99,扩增效率满足90%-110%。

2. 实验操作分区,避免检测样品交叉污染

3. 模板及引物预实验严格质控,NanoDrop检测RNA样品的浓度和纯度,并结合琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量;等量RNA模版制备cDNA/miRNAs,等量cDNA/miRNAs模版进行qPCR检测,最大限度做到条件一致。

4. 免费提供内参基因检测及引物预实验条件。也可根据实验特殊性进行多内参检测和比较。

 

 

三.服务内容:

分类

服务项目

绝对荧光定量

建立标准品标准曲线,检测样本中的目的基因,通过与标准曲线比对,得到检测目的基因的准确拷贝数,可选SYBR染料法和Taqman探针法

相对荧光定量

免费提供内参基因,采用2-△△Ct法计算检测目的基因的相对表达量,可选SYBR染料法和Taqman探针法

 

1)多物种多样品,总RNA提取,cDNA合成或成熟体miRNAs合成(加尾法);

2)预实验检测cDNA/miRNAs模板及引物特异性;

3)QPCR扩增曲线(三次技术重复避免系统误差)、熔解曲线(检测扩增质量),5-8点构建标准曲线;

4)待测基因、miRs表达差异分析(相对定量);

5)生物制剂、生物样本中待测核酸残留量检测(绝对定量);

6)SNP分型

7)详细的实验报告(包含实验使用的仪器试剂、实验步骤及实验结果)

 

四.服务流程:

五、送样须知:

本公司接受任何类型的样本,对于不同的样本最低需求量略有不同,具体要求如下描述,亦可电话咨询。客户还需提供其他详细信息:如物种信息,待测基因的序列、GeneID、miRNA名称等。

 

1、组织样品:不少于100mg,如组织块较大,请尽可能剪碎,避免因整块反复冻融导致样品降解,然后浸泡在组织RNA保存液中,低温寄送。

2、细胞样品:六孔板的1/样80~90%融合度)PBS清洗、收集细胞、去上清后,加1ml Trizon重悬,短期低温保存低温运送;或细胞沉淀直接液氮速冻,-80℃可长期,干冰寄送,确保无冻融。

3、痕量样本(外泌体等):新鲜样本即刻低温运输;长期保存的冷冻样本,干冰寄送,无冻融,已能有效扩增内参为质检合格。

4、病毒样品:不少于200ul病毒液;冰袋低温寄送。

5、细菌样品1ml~1.5ml饱和菌液样品;离心后去尽上清;液氮速冻,-80℃保存,干冰寄送,全程确定样品无冻融。

6、RNA样品:干冰寄送。以本实验室收到RNA样本后的电泳检测结果为准;如电泳检测RNA质量不合格,需重新提供样品。

7、血液样本:请将新鲜血液直接收集到“血液RNA保存管”中,混匀后即刻低温运送,或低温保存后干冰运输。

 

五、荧光定量PCR实验服务报告内容:
1、RNA浓度及纯度检测,引物、探针预实验扩增效果及特异性检测;

2 绝对定量:“标准品”载体构建、测序结果;

3qPCR原始数据、计算、分析结果;完整的实验步骤、仪器参数、软件设置等信息。

 

六、实验服务周期及收费标准:

内容

单价

周期

mRNA提取及cDNA合成

100/样品

1~3

miRNA提取及cDNA合成

300/样品

1~3

引物设计、合成

40/

2

探针设计、合成

800/

7

预实验(检测引物扩增效率)

免费

1~3

qPCR检测

(免费检测1内参)

80/3个复孔/指标/样品(染料)

2-7

100/3个复孔/指标/样品(探针)

100/3个复孔/指标/样品miRNA,加尾法

注:100个以上检测指标(样品数*基因数>100),折扣详询

七、结果示例:

 

例一 目的基因表达检测,包含RNA电泳图、引物特异性预实验、扩增曲线、熔解曲线

 

A. RNA电泳检测图                             B. 扩增曲线

    C.引物扩增及特异性预实验检测                 D. 熔解曲线


例二miRNA表达检测


例三:绝对定量,5点稀释梯度各18复孔标准曲线制作,R2值超过0.999





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