荧光定量PCR（qPCR）技术概述

一、qPCR概述——“做的就是专业”：
  基本原理不必赘述！！！方法学上可分为两类：染料法（下左图）和探针法（下右图）。几乎每个实验室/平台都配备了qPCR仪，几乎每位研究生也都会说“我会做qPCR”，但你真的会做吗，计算的结果可靠吗，又是否可以灵活应用呢？

    以下几个问题如果你遇到过且解决不了，那你需要我们：1）每次实验前对于几个样品几对引物几组重复，在计算Mix和加样的时候都要疯了？ 2）RNA及cDNA的模版质量是否关注过并能区分好坏？以及OD值对于痕量样本的参考意义？3）是否遇到过不同内参的检测差异就很大，又该用哪个内参进行回归计算呢？ 4）熟悉染料法的你，是否了解什么情况下应该用探针法，以及引物和探针设计的技巧呢？ 5）溶解曲线双峰、杂峰的解读？ 6）复孔之间结果的差异辨别，以及孔板边缘效应？ 7）了解反应体系内是否应该含有内标，以及内标对于结果的影响吗？ 8）最后，会做标准曲线并能计算核酸绝对含量的人应该就少之又少了吧？

二、服务优势：

1. Bio-Rad CFX96定量PCR系统，定期检测、维护各孔的扩增表现。能做到8点各18个复孔标曲的R²>0.99，扩增效率满足90%-110%。

2. 实验操作分区，避免检测样品交叉污染

3. 模板及引物预实验严格质控，NanoDrop检测RNA样品的浓度和纯度，并结合琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量；等量RNA模版制备cDNA/miRNAs，等量cDNA/miRNAs模版进行qPCR检测，最大限度做到条件一致。

4. 免费提供内参基因检测及引物预实验条件。也可根据实验特殊性进行多内参检测和比较。

三．服务内容：

1）多物种多样品，总RNA提取，cDNA合成或成熟体miRNAs合成（加尾法）；

2）预实验检测cDNA/miRNAs模板及引物特异性；

3）QPCR扩增曲线（三次技术重复避免系统误差）、熔解曲线（检测扩增质量），5-8点构建标准曲线；

4）待测基因、miRs表达差异分析（相对定量）；

5）生物制剂、生物样本中待测核酸残留量检测（绝对定量）；

6）SNP分型

7）详细的实验报告（包含实验使用的仪器试剂、实验步骤及实验结果）

四．服务流程：

五、送样须知：

本公司接受任何类型的样本，对于不同的样本最低需求量略有不同，具体要求如下描述，亦可电话咨询。客户还需提供其他详细信息：如物种信息，待测基因的序列、GeneID、miRNA名称等。

1、组织样品：不少于100mg，如组织块较大，请尽可能剪碎，避免因整块反复冻融导致样品降解，然后浸泡在组织RNA保存液中，低温寄送。

2、细胞样品：六孔板的1孔/样（80~90%融合度），PBS清洗、收集细胞、去上清后，加1ml Trizon重悬，短期低温保存低温运送；或细胞沉淀直接液氮速冻，-80℃可长期，干冰寄送，确保无冻融。

3、痕量样本（外泌体等）：新鲜样本即刻低温运输；长期保存的冷冻样本，干冰寄送，无冻融，已能有效扩增内参为质检合格。

4、病毒样品：不少于200ul病毒液；冰袋低温寄送。

5、细菌样品：1ml~1.5ml饱和菌液样品；离心后去尽上清；液氮速冻，-80℃保存，干冰寄送，全程确定样品无冻融。

6、RNA样品：干冰寄送。以本实验室收到RNA样本后的电泳检测结果为准；如电泳检测RNA质量不合格，需重新提供样品。

7、血液样本：请将新鲜血液直接收集到“血液RNA保存管”中，混匀后即刻低温运送，或低温保存后干冰运输。

五、荧光定量PCR实验服务报告内容：
1、RNA浓度及纯度检测，引物、探针预实验扩增效果及特异性检测；

2、 绝对定量：“标准品”载体构建、测序结果；

3、qPCR原始数据、计算、分析结果；完整的实验步骤、仪器参数、软件设置等信息。

六、实验服务周期及收费标准：

七、结果示例：

例一： 目的基因表达检测，包含RNA电泳图、引物特异性预实验、扩增曲线、熔解曲线

A. RNA电泳检测图                             B. 扩增曲线

    C.引物扩增及特异性预实验检测                 D. 熔解曲线

例二：miRNA表达检测